高效的液相色譜儀

高效液相色譜儀(HPLC)是運用高效液相色譜原理，首要用于剖析高沸點不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機化合物的儀器設(shè)備。它由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的活動相被高壓泵打入體系，樣品溶液經(jīng)進樣器進入活動相，被活動相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)，因為樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對運動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配進程，各組分在移動速度上發(fā)生較大的不同，被別離成單個組分順次從柱內(nèi)流出，經(jīng)過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜方法打印出來。HPLC廣泛運用于生命科學(xué)、食品科學(xué)、藥物研討以及環(huán)境研討中。

原理

儲液器中的活動相被高壓泵打入檢測體系，樣品溶液經(jīng)進樣器進入活動相，被活動相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，因為樣本溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運動時，經(jīng)過反復(fù)多次的“吸附-解吸”的分配進程，各組分在移動速度上發(fā)生較大的不同，被別離成單個組分順次從柱內(nèi)流出，經(jīng)過檢測器時，樣本濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜方法輸出檢測成果。

依據(jù)別離機制的不同，HPLC原理可分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交流色譜法及分子排阻色譜法。

1. 液固吸附色譜法

液固吸附色譜法中，固定相為固體吸附劑，依據(jù)各組分吸附才能差異而使組分得以別離。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，大多數(shù)用于非離子型化合物。吸附色譜固定相能夠分為極性和非極性兩大類。對活動相的要求為：

1) 選用的溶劑應(yīng)當(dāng)與固定彼此不相溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性。

2) 選用的溶劑應(yīng)有高純度，以防所含微量雜質(zhì)在柱中堆集，引起柱功用的改動。

3) 選用的溶劑功用應(yīng)與所運用的檢測器相匹配，如果運用紫外吸收檢測器，就不能選用在檢測波長下有紫外吸收的溶劑；若運用示差折光檢測器，就不能用梯度洗脫。

4) 選用的溶劑應(yīng)對樣品有足夠的溶解才能，以進步測定的靈敏度。

5) 選用的溶劑應(yīng)具有低的黏度和恰當(dāng)?shù)偷姆悬c。

6) 應(yīng)盡量避免運用具有顯著毒性的溶劑，以保證工作人員的安全。

液固色譜法是以外表吸附功用力為依據(jù)的，所以它常用于別離極性不同的化合物，也能別離那些具有相同極性基團，但數(shù)量不同的樣品。

2. 液液分配色譜法

固定相為液體，依據(jù)被別離的組分在活動相和固定相中的溶解度不同而別離。依固定相和活動相的極性不同可分為正相色譜法和反相色譜法。正相色譜法選用極性固定相，活動相為相對非極性的疏水性溶劑，常用于別離中等極性和極性較強的化合物；反相色譜法一般用非極性固定相，活動相為水或緩沖溶液，適用于別離非極性和極性較弱的化合物。其間，反相色譜運用*廣。

3. 離子交流色譜法

固定相是離子交流樹脂。樹脂上可電離離子與活動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行交流，依據(jù)各離子與離子交流基團具有不同的電荷吸引力而別離。

4. 分子排阻色譜法

分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，它是依照分子尺度大小順序進行別離的一種色譜辦法。分子排阻色譜法的固定相凝膠是一種多孔性的聚合資料，有必定的形狀和穩(wěn)定性，運用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻才能的差異而完結(jié)別離。依據(jù)所用活動相的不同，凝膠色譜法能夠分為兩類：即用水溶劑做活動相的凝膠過濾色譜法(GFC)與用有機溶劑如四氫呋喃做活動相的凝膠滲透色譜法(GPC)。

延伸

在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中停留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則停留時間短，先流出色譜柱�；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越簡單別離，因而混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜別離的前提。

在HPLC中，固定相確定后，K首要受活動相的性質(zhì)影響。實踐中首要靠調(diào)整活動相的組成配比及pH值，以取得組分間的分配系數(shù)差異及適合的保存時間，達到別離的目的。

色譜

（high performance liquid chromatography,HPLC）也叫高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography）、高速液相色譜（high speed liquid chromatography）、高別離度液相色譜（high resolution liquid chromatography）等或Efficient liquid chromatographyspectrometry。是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而敏捷發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓運送活動相，故又稱高壓液相色譜。又因剖析速度快而稱為高速液相色譜。

高效液相色譜是運用*多的色譜剖析辦法，高效液相色譜體系由活動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其全體組成類似于氣相色譜，可是針對其活動相為液體的特點作出許多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn)；進樣體系要求進樣便當(dāng)切換嚴(yán)密；因為液體活動相粘度遠遠高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠小于氣相色譜柱。HPLC運用十分廣泛，幾乎遍及定量定性剖析的各個領(lǐng)域。

運用高效液相色譜時，液體待檢測物被注入色譜柱，經(jīng)過壓力在固定相中移動，因為被測物種不同物質(zhì)與固定相的彼此作用不同，不同的物質(zhì)順序離開色譜柱，經(jīng)過檢測器得到不同的峰信號，*后經(jīng)過剖析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質(zhì)。高效液相色譜作為一種重要的剖析辦法，廣泛的運用于化學(xué)和生化剖析中。高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有實質(zhì)的不同，它的特點是選用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，適于剖析高沸點不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。

結(jié)構(gòu)及功用

HPLC儀一般由溶劑運送體系、進樣體系、別離體系（色譜柱）、檢測體系和數(shù)據(jù)處理與記錄體系組成，詳細包括儲液器、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀或數(shù)據(jù)工作站等幾部分。其間輸液泵、色譜柱和檢測器是HPLC儀的關(guān)鍵部分。

1. 溶劑運送體系

儲液器：用來貯存數(shù)量足夠、符合要求的活動相。配有溶劑過濾器，以避免活動相中的顆粒進入泵內(nèi)。

脫氣器：脫氣的目的是為了避免活動相從色譜柱內(nèi)流出時釋放出氣泡進入檢測器，然后引起噪聲，不能正常檢測。

輸液泵：將儲液器中的活動相連續(xù)不斷地以高壓方法進入液路體系，使樣品在色譜柱中完結(jié)別離進程。

梯度洗脫設(shè)備：是在別離進程中經(jīng)過逐漸改動活動相的組成添加洗脫才能的一種設(shè)備。

2. 進樣體系

進樣器：是將樣品送入色譜柱的設(shè)備，進樣方法能夠分為兩種：閥進樣或自動進樣。比較常用的是選用自動進樣器裝樣。

3. 別離體系

色譜柱：對樣品進行別離，是整個色譜體系的心臟，它的質(zhì)量好壞直接影響到別離的作用。

4. 檢測體系